1996年,美国Applied Biosystems公司首次引入了实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, real-time qPCR)。所谓Real-time qPCR,是指在PCR反应中加入荧光基团,持续监测荧光信号。根据出现顺序和信号强度的变化可以实时分析目标基因的初始数量。该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。
目前,Real-time qPCR根据所使用的荧光化学物质的不同,分为荧光染料和荧光探针两大类。
荧光染料也被称为DNA结合染料。目前使用的主要染料分子是SYBR Green I. SYBR Green I可以特异性结合到DNA双链的小凹槽上。游离SYBR Green I几乎没有荧光信号,但能与双链DNA结合。之后,它的荧光信号可以增加数百倍。随着PCR产物的增加,PCR产物与染料的结合量也随之增加,荧光信号强度代表双链DNA分子的数量。
荧光染料的优点是使用方便,可与任何PCR产物结合,价格低廉。
总的来说,SYBR Green I法是最基础、最常用的实时qPCR实验之一。
在Real-time qPCR中最常用的荧光探针是TaqMan探针。其基本原理是设计和合成一种特异杂交于靶基因的探针。探针的5'端标记有荧光团,3'端标记有淬灭基团。
正常情况下,两组之间的空间距离非常近,荧光基因因猝灭而不能发出荧光。PCR扩增时,引物和探针同时与模板结合,探针的结合位置位于上下游引物之间。
当扩增延伸到探针结合的位置时,Taq酶利用5'外切酶的活性将连接在探针5'端上的荧光分子从探针上切割下来,使其发出荧光。检测到的荧光分子数与PCR产物数成正比,因此可以根据PCR反应体系中的荧光强度计算初始DNA模板数。
TaqMan探针技术解决了荧光染料与非特异性扩增相结合的问题。反应结束后,无需熔解曲线检测,缩短了试验时间。
TaqMan探针技术的优点是荧光背景低,灵敏度高,杂交稳定性好,荧光光谱分辨率好,特异性高。
由于TaqMan探针具有较高的特异性,可用于等位基因的鉴别,尤其是人类基因多态性的鉴别,并可基于SNP对菌株进行区分和量化。