实时荧光定量PCR的基本原理

1.实时定量聚合酶链反应

1996年，美国Applied Biosystems公司首次引入了实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, real-time qPCR)。所谓Real-time qPCR，是指在PCR反应中加入荧光基团，持续监测荧光信号。根据出现顺序和信号强度的变化可以实时分析目标基因的初始数量。该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。

2.用于PCR荧光的化学物质

目前，Real-time qPCR根据所使用的荧光化学物质的不同，分为荧光染料和荧光探针两大类。

3.用于PCR荧光的染料

荧光染料也被称为DNA结合染料。目前使用的主要染料分子是SYBR Green I. SYBR Green I可以特异性结合到DNA双链的小凹槽上。游离SYBR Green I几乎没有荧光信号，但能与双链DNA结合。之后，它的荧光信号可以增加数百倍。随着PCR产物的增加，PCR产物与染料的结合量也随之增加，荧光信号强度代表双链DNA分子的数量。

荧光染料的优点是使用方便，可与任何PCR产物结合，价格低廉。

总的来说，SYBR Green I法是最基础、最常用的实时qPCR实验之一。

4.PCR荧光探针

在Real-time qPCR中最常用的荧光探针是TaqMan探针。其基本原理是设计和合成一种特异杂交于靶基因的探针。探针的5'端标记有荧光团，3'端标记有淬灭基团。

正常情况下，两组之间的空间距离非常近，荧光基因因猝灭而不能发出荧光。PCR扩增时，引物和探针同时与模板结合，探针的结合位置位于上下游引物之间。

当扩增延伸到探针结合的位置时，Taq酶利用5'外切酶的活性将连接在探针5'端上的荧光分子从探针上切割下来，使其发出荧光。检测到的荧光分子数与PCR产物数成正比，因此可以根据PCR反应体系中的荧光强度计算初始DNA模板数。

TaqMan探针技术解决了荧光染料与非特异性扩增相结合的问题。反应结束后，无需熔解曲线检测，缩短了试验时间。

TaqMan探针技术的优点是荧光背景低，灵敏度高，杂交稳定性好，荧光光谱分辨率好，特异性高。

由于TaqMan探针具有较高的特异性，可用于等位基因的鉴别，尤其是人类基因多态性的鉴别，并可基于SNP对菌株进行区分和量化。